Peter Parker a commencé à se sentir bien dans sa vie et il veut se marier avec Mary Jane. Pendant une nuit au parc, alors que Peter et Mary Jane sont ensemble, un petit météorite tombe tout près sur le lieu où ils sont, et une particule s'en échappe, libérant, en éclatant, une matière visqueuse, la Venom, qui s'attache à la mobylette de Peter. En attendant, Flint Marko s'est échappé de la prison où il était détenu pour cambriolage afin d'aller revoir sa fillette à qui il manque terriblement, mais dont il n'a pas le droit de s'approcher à cause de l'injonction d'éloignement obtenu contre lui par son ex-femme, et il tombe dans un accélérateur de particules, qui fond son corps avec le sable et il devient l’Homme-Sable. Le meilleur ami de Peter, Harry Osborn, veut venger la mort de son père, et, croyant que Peter est la cause de cette mort, l'attaque. La bataille laisse Harry avec une amnésie à court temps, lui faisant oublier sa vendetta.
Dans la version française de Spider-Man 3, le restaurant français où Peter demande Mary-Jane en mariage devient un restaurant italien, mais son nom reste "Le Restaurant Constellation". C'est dans cette scène que l'on voit Bruce Campbell (qui avait déjà fait une apparition dans les deux premiers Spider-Man). Dans le troisième épisode, il joue le rôle d'un maître d'hôte français (italien dans la VF).

Stan Lee apparaît dans la scène de Time Square. Pour la première fois, il s'entretient avec Tobey Maguire.

L'actrice qui joue le rôle de Gwen Stacy est en fait Bryce Dallas Howard, la fille du réalisateur Ron Howard.

Le choix du méchant du troisième épisode s'est fait selon les préférences de Tobey Maguire, ce dernier ayant un jour affirmé que l'homme-sable était son méchant préféré.

Sam Raimi ne voulait pas inclure le personnage de Venom dans cet épisode, son idée originale étant de confronter dans ce film Spider-Man à des criminels "humains", le forçant à remettre en question son existence en tant que superhéros mais la pression des fans additionnée à celle du producteur Avi Arad l'a contraint à céder. On voit cependant une très nette différence de traitement entre les deux méchants : l'homme-sable bénéficie d'une histoire poignante (sa fille est malade) tandis que Eddie Brock ne cherche qu'à se venger de l'humiliation que Peter lui a faite au journal.

Pour le troisième film, le compositeur Danny Elfman (auteur des musiques des deux premiers films) laisse la place à Christopher Young. Ce dernier réutilise les thèmes les plus connus (celui de Spider-Man et du Bouffon Vert) et en ajoute de nouveaux (Spider-Man en noir, l'homme-sable) avec une telle aisance que le changement de compositeur ne se remarque quasiment pas à l'écoute de la musique, tant les deux styles se ressemblent et se complètent.

Contrairement à la bande originale de Spider-Man et Spider-Man 2, celle de Spider-Man 3 n'a pas été éditée. Seul un CD ne contenant que des chansons rock (qui ne figurent même pas dans le long-métrage) est sorti. On ignore encore si le CD de la bande originale sortira un jour et de nombreux fans s'indignent d'un tel irrespect pour la musique de films.

Christopher Young apparaît dans le film. Il est la personne qui discute avec le pianiste lorsque Mary-Jane arrive dans l'auditorium et se rend compte qu'elle a été remplacée par une autre chanteuse.

Dans les commentaires figurant sur le DVD, il est dit que la seule conception de la scène de la naissance de l'Homme-Sable a coûté à elle seule le budget du premier film Spider-Man, à savoir 100 millions de dollars.

Le générique d'ouverture du troisième film reprend les mêmes ingrédients que ceux des deux premiers. Musicalement, on retrouve le thème de Spider-Man ainsi que les deux autres thèmes majeurs du film, à savoir celui de Spider-Man en noir et celui de l'Homme-Sable. Visuellement, la première partie ne diffère pas mais dès l'apparition du titre, on retrouve un patchwork des scènes marquantes des précédents épisodes qui font office de résumé visuel pour rappeler les différents faits survenus auparavant.

Dans ce film, l'être que forment ensemble Eddie Brock et le symbiote n'est jamais appelé Venom. Son nom est seulement révélé au générique de fin.