Cela fait deux ans que Peter Parker passe son temps, entre ses cours et ses loisirs, à lutter contre les malfaiteurs sous l'identité de Spider-Man. Convaincu que Spider-Man a tué son père, son meilleur ami Harry Osborn l'invite à rencontrer le docteur Otto Octavius, persuadé d'avoir découvert une source d'énergie aussi puissante que le Soleil.
On peut voir l'apparition très rapide de Stan Lee, le créateur des comics lors du pillage d'une banque par le Docteur Octopus : il est un vieil homme sauvant une passante d'un bloc de roche lui tombant dessus.

Bruce Campbell, le héros de la trilogie Evil Dead également réalisée par Sam Raimi, joue le rôle du portier du théâtre.

On peut supposer aussi un clin d'oeil à Evil Dead lors de la scène de l'opération du Dr Octopus où l'un des chirurgiens brandi une tronçonneuse.

Tobey Maguire a failli ne pas rempiler pour le rôle de Peter Parker à cause de ses problèmes de dos. S'il avait dû se retirer, l'acteur Jake Gyllenhaal était pressenti pour reprendre le flambeau. À noter que Sam Raimi se moque gentiment des problèmes de dos de l'acteur lors de la scène où Peter saute du toit d'un immeuble ("I'm back!" (VO) signifiant "Je suis de retour !" ; "Ça va faire mal !" (VF)) et tombe ("Ooooh, my back..." (VO) signifiant "Oooh mon dos..." ; "Ça fait mal..." (VF)).

On notera un petit caméo de Thomas Jane alias Punisher au moment où Kirsten Dunst sort de l'église en courant.