Léonidas est devenu roi de Sparte à la suite des épreuves rituelles spartiates dont il a triomphé. Il apprend d'un messager perse que le roi Xerxès envisage d'envahir la Grèce et de soumettre sa cité mais refuse de négocier un quelconque arrangement. Contre l'avis des éphores corrompus par l'or perse, il part à la rencontre de l'ennemi avec les 300 meilleurs soldats de sa cité, et est rejoint sur la route par Daxos et ses Arcadiens. Léonidas choisit de combattre l'armée perse dans le passage étroit et rocheux des Thermopyles. Il refuse d'enrôler Éphialtès, un Spartiate exilé, car celui-ci, bossu, ne peut lever convenablement son bouclier à cause de son handicap.

Face à l'armée gigantesque conduite par le roi Xerxès en personne, la résistance est héroïque mais désespérée. Xerxès, frappé par les importantes pertes subies par son armée lors des premiers assauts, tente de gagner Léonidas à sa cause mais essuie un échec. Il envoie alors ses meilleurs guerriers, les Immortels, ceux-ci étant également repoussés par les Spartiates. Mais Éphialtès, meurtri par le refus de Léonidas, révèle à Xerxès l'existence d'un sentier secret qui contourne les Thermopyles. Les Arcadiens battent en retraite en apprenant la nouvelle et Léonidas, conscient que son destin est désormais scellé, envoie Dilios, un de ses guerriers, à Sparte avec ordre de narrer l'histoire du sacrifice de ses camarades.
Zack Snyder a réalisé le film courant 2006. Le film a recours aux mêmes procédés techniques que le film Sin City (adapté lui aussi d'une bande dessinée de Frank Miller), avec l'utilisation massive d'images de synthèse.

Même si toutes les scènes présentes dans la bande dessinée originale sont fidèlement reconstituées sur grand écran, le scénario a été complété de quelques personnages et scènes supplémentaires :

Dans la bande dessinée, Éphialtès, qui finit par trahir les Spartiates (et qui est une sorte de monstre difforme dans le film), tente de se suicider lorsque Léonidas refuse de faire de lui un guerrier. Dans le film, la scène fut tournée, mais coupée au montage.

Toutes les scènes se déroulant à Sparte qui impliquent la reine et montrent les intrigues politiques au sein de la cité ont été ajoutées pour renforcer l'unique rôle féminin.

Des éléments fantastiques et divers monstres comme le rhinocéros ont été ajoutés.

Le film a été presque entièrement tourné sur fond bleu et vert, aux Ice Storm Studios de Montréal4. Seule la scène de chevauchée des messagers au début du film, impossible à réaliser en studio, a été tournée en extérieur.

Près de 1 300 effets visuels ont été nécessaires, soit une moyenne d'un effet visuel par plan.

Les acteurs ont suivi un entraînement sportif intensif de plus de huit semaines avant le début du tournage.

Dans ce film, les acteurs Gerard Butler et Andrew Pleavin jouent à nouveau ensemble, cinq ans après leur collaboration dans Attila le Hun de Dick Lowry. Gerard Butler avait là encore le rôle principal, tandis qu'Andrew Pleavin interprétait Flavius Oreste, un fidèle général d'Attila.